Пущинский государственный университет

магистратура      |      аспирантура      |      повышение квалификации

Государственный контракт № П609 от 18.05. 2010 г. (мероприятие 1.2.1)

Тема:
«Новый фундаментальный подход к созданию остеоиндуктивных материалов нового поколения для травматологии и ортопедии на основе применения рекомбинантного морфогенетического белка BMP-2».

Цель:
Целью выполнения НИР является создание материалов нового поколения для травматологии, ортопедии и челюстно-лицевой хирургии, обладающих высоким остеоиндуктивным потенциалом за счет применения рекомбинантных морфогенетических остеогенных белков семейства ВМР, а также подготовка научных кадров, работающих в области фундаментальной медицины и тканевой инженерии.

Основные результаты проекта:
  1. Наработана партия рекомбинантного белка rhBMP-2 в бактериальной системе экспрессии (E. coli). Рекомбинантный белок BMP-2 нарабатывался в бактериальном штамме E.coli BL21(DE3) Codon Plus с рекомбинантного плазмидного вектора pET28a содержащего вставку синтетического гена человеческого ростового фактора BMP-2.
  2. Разработаны протоколы хранения активного белка rhBMP-2. После выделения из телец включения и очистки рекомбинантного белка BMP-2 было показано, что около 80% белка находилось в димерной форме, а около 20% - в мономерной форме. При оценке сохранения белка при 4?С обнаружено, что содержание димерной формы белка после 6 месяцев хранения в 10мМ растворе уксусной кислоты остается неизменным.
  3. Поставлена методика изучения активности рекомбинантного человеческого белка BMP-2 в культуре клеток (оценка активности щелочной фосфатазы и продукции коллагена под действием rhВМР-2 и при добавлении аскорбиновой кислоты, бета-глицерофосфата и дексаметазона). На модели клеток линии С3Н10Т1/2 изучена биологическая активность полученных рекомбинантных белков rhВМР-2 in vitro. Установлено, что производенный нами рекомбинантный белок hBMP-2 имеет остеоиндуктивную активность совпадающую с активностью белков ВМР-2, производимых в эукариотических клетках.
  4. Проведен патентный поиск по ГОСТ Р 15.011-96 согласно предметной области проекта. Патентная чистота результатов НИР подтверждена патентными исследованиями, подана заявка на изобретение в РФ.
  5. Разработаны методы иммобилизации rhBMP-2 в гелеообразном композиционном материале.
  6. Разработаны методы иммобилизации rhBMP-2 в активной форме в деминерализованном костном матриксе.
  7. Разработаны методы и протоколы модификации деминерализованной костной ткани белком rhВМР-2 и цитокинами хемоатрактантами;
  8. Разработан подход к изучению биологической активности полученного белка rhВМР-2 in vivo. Выбрана модель гетеротопической подкожной имплантации крысам (создание полости имплантации «тупым» способом, без повреждения кровеносных сосудов области имплантации) и модель ортотопической имплантации (создание дефекта костной ткани диаметром 5-6 мм середины свода черепа крыс с помощью круговой стоматологической фрезы). Срок 6 недель. Условия содержания – ad libitum.
  9. Изучена биологическая активность белков rhВМР-2 и степень минерализации разработанных материалов в модели подкожной имплантации крысам. Показано, что введение rhBMP–2 в составе альгинатного геля во фрагмент деминерализованного костного матрикса радикально (в 20 и более раз) увеличивает минерализацию имплантов в модели подкожной имплантации крысам.
  10. Определены морфологические особенности и динамика остеогенеза в материалах, модифицированных белком rhВМР-2, при подкожной имплантации крысам. Установлено, что введение rhBMP-2 в остеокондуктивный материал обеспечивает увеличение выработки структурированного коллагенового матрикса (формирование нового костного матрикса) и увеличивает степень минерализации костного матрикса остеобластами (увеличение дифференцировки клето-предшественников), что в целом значительно увеличивает срок регенерации костной ткани в организме реципиента по сравнению с материалами без rhBMP-2.
  11. Изучена минерализация разработанных материалов в модели ортотопической имплантации крысам. Показано, что при ортотопической имплантации в материалах содержащих rhBMP-2, происходит активная минерализация новообразованного матрикса, в то время, как в материале, не содержащем rhBMP-2, минерализации матрикса не наблюдалось.
  12. Изучена эффективность минерализации материалов, включающих rhВМР-2, а также рекомбинантные цитокины PDGF (тромбоцитарный ростовой фактор) и VEGF (фактор роста эндотелия сосудов), в модели подкожной и ортотопической имплантации крысам. Полученные результаты указывают на возможность использования производимого нами белка rhBMP-2 как в качестве моноиндуктора остеогенеза в разрабатываемых остеоиндуктивных материалах, так и в сочетании с рекомбинантным фактором роста тромбоцитов. Установлено, что при использовании стандартных кондуктивных материалов (ДКМ, гидроксиапатит, коллаген и т.п.), модифицированных rhBMP-2 и PDGF наблюдается выраженное усиление процессов регенерации и ремоделирования костной ткани в модели ортотпической имплантации. При этом регенерация кости в данном случае обходила, считавшуюся до недавнего времени обязательной, стадию резорбции костной ткани. При проведении исследований показано, что при использовании правильно фиксированных на материале–носителе рекомбинантных белков rhBMP-2 и PDGF BB (с заданным периодом выхода) наблюдается ремоделирование костной ткани, аналогично таковой при стабильном остеосинтезе (ремоделирование без резорбции некротической кости), что свидетельствует о выраженном остеоиндуктивном действии разрабатываемых материалов. Полученные результаты указывают на необходимость разработки способа получения рекомбинантного ростового фактора PDGF в бактериальной системе экспрессии E. Coli. Данные разработки позволят значительно повысить эффективность остеоиндуктивного потенциала создаваемых материалов, а также повысят доступность и позволят снизить себестоимость разрабатываемых материалов для травматологии, ортопедии, стоматологии, и челюстно-лицевой хирургии.
  13. Новые данные, полученные за время проведения работ по проекту являются крайне важными для разработки способов фиксации rhBMP-2 и цитокинов – хемоаттрактантов мезенхимальных клеток реципиента в натуральных гелеобразных носителях и деминерализованном костном матриксе и могут быть рекомендованы для разработки способов создания остеоиндуктивных материалов нового поколения. Получены четкие данные, указывающие на качественное увеличение остеоиндуктивности в моделях подкожной и ортотопической имплантации за счет использования полученного в проекте рекомбинантного морфогенетического белка rhBMP-2, а также выбранных сочетаний и концентраций цитокинов (GF). Полученные результаты рекомендованы к патентованию в соответствии с законодательством Российской Федерации об интеллектуальной собственности.


Гистологические препараты образцов деминерализованного костного матрикса, включающих PDGF
б– стрелкой указаны очаги начальной минерализации новообразованного матрикса

Использование моделей гетеро- и ортотопической имплантации остеопластических материалов крысам

Гистологические препараты образцов деминерализованного костного матрикса, включающих rhBMP-2 и PDGF

в– стрелкой указана новообразованная костная ткань, созревающий коллаген а– окраска гематоксилин Карацци/Эозин Y, световая микроскопия; б– окраска Ализариновый красный S/толуидиновый синий, световая микроскопия (стрелкой указано образование новых костных трабекул); в– окраска ядерным красителем Этидиум бромидом, конфокальная микроскопия; 1–коллаген ДКМ, 2– новообразованный фиброзный матрикс; 3– новообразованная костная ткань.


Основные результаты проекта:

  1. Опубликовано 6 статей в рецензируемых журналах из списка ВАК, в том числе и в иностранной печати.
    • Ravil Muratov, Dmitriy Britikov, Anton Sachkov, Vladimir Akatov, Valeriy Soloviev, Irina Fadeeva, Leo Bockeria. New approach to reduce allograft tissue immunogenicity. experimental data. Interact. Cardiovasc. Thorac. Surg., 2010, V. 10(3), p. 408-412.
    • Акатов В.С., Чеканов А.В., Фадеева И.С. Клеточные технологии для регенеративной медицины. / Под ред. Г.И. Пинаева и др., 2011, 333 cтр., ISBN 987-5-7422-3489-0, СПб., изд.-во Политехнического ун-та
    • Чеканов А.В., Фадеева И.С., Акатов В.С., Соловьева М.Е., Вежнина Н.В., Лекишвили М.В. Количественный эффект повышения остеоиндуктивности материала за счет включения в него рекомбинантного морфогенетического белка кости rhВМР-2. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия, 2012, Том VII, №2, с. 70-76.
  2. Сделано 11 докладов на российских и международных конференциях, симпозиумах и конгрессах.
  3. Опубликовано 2 монографии в иностранных научных издательствах:
    • Акатов В.С., Фесенко Н.И., Фадеева И.С. Кальцификация трансплантатов клапанов сердца и сосудов. Механизмы кальцификации и её предотвращение. 2012, 248 стр., ISBN 978-3-659-23289-3, AV Akademikerverlag GmbH & Co. KG (Germany).
  4. Защищено 3 кандидатских диссертаций.
  5. Зачислено в штат Научно-исследовательских институтов РАН: 4 молодых участника проекта
  6. Принято в аспирантуру: 3 человека.
Дополнительные материалы:
pdf Результаты научно-исследовательских работ, полученные при выполнении Государственного контракта № П609 от 18 мая 2010 года.
*

 
© Пущинский государственный естественно-научный институт, 2004-2014.
Разработка и техническая поддержка © Специализированный центр новых информационных технологий
eldis