Василий Пустовойт родился 14 января 1886 года в селе Тарановка, Украина. После школы обучался в училище города Змиев. В 1907 году окончил Харьковское земледельческое училище, а в следующем году и педагогический класс при нем.
С 1908 года на протяжении десяти лет Пустовойт преподавал в Кубанской войсковой сельскохозяйственной школе. Параллельно, являлся помощником управляющего школой. По совместительству работал агрономом в станице Петропавловская, Краснодарского края. Внедрял протравку семян пшеницы перед посадкой для их защиты от вредителей.
Пустовойт в 1912 году организовал при Кубанской сельскохозяйственной школе опытно-селекционное поле «Круглик». Проводил опыты с подсолнечником, озимой пшеницей, рожью, просом, кукурузой. В период с 1918 по 1924 год преподавал в Кубанском сельскохозяйственном техникуме. С 1924 года руководил селекционной станцией масличных культур.
В 1926 году Василий Степанович окончил Кубанский сельскохозяйственный институт и стал заведующим кафедрой генетики, селекции и семеноводства Кубанского сельскохозяйственного института. Занимал должность до 1930 года.
Пустовойта в августе 1930 года арестовали по ложному доносу и осудили на десять лет лагерей. В заключении занимался селекцией местных культур. В мае 1934 года досрочно освободился, после чего получил должность директора Центрального опытного поля Карлага, Карагандинского лагеря. Вывел на созданном им опытном поле урожайный сорт ржи и два вида проса.
С мая 1936 года Пустовойт заведовал отделом селекции и семеноводства масличных культур и лабораторией селекции подсолнечника Всесоюзного научно-исследовательского института масличных культур в городе Краснодар. Выступал одним из инициаторов селекции подсолнечника на высокую масличность. Разработал новые высокоэффективные системы селекции улучшающего семеноводства подсолнечника. Создал 34 сорта подсолнечника.
Василий Степанович разрабатывал вопросы агротехники и селекции подсолнечника, пшеницы и кукурузы, исследовал проблемы земледелия и растениеводства. Заложил новое направление в селекции подсолнечника на качество масла с использованием межлинейной гибридизации, которое завершилось созданием первого в мире высокоолеинового сорта «Первенец». Также, успешно решил проблему создания заразиховыносливых сортов подсолнечника. Разработал новую систему семеноводства подсолнечника, основанную на ежегодном сортообновлении.
Пустовойт являлся Академиком Российской академии наук и Всесоюзной академии сельскохозяйственных наук. Трижды избирался депутатом Верховного Совета Российской Федерации. Удостоен ученой степени доктора сельскохозяйственных наук.
За особые заслуги в развитии сельскохозяйственной науки удостоен дважды Почетного звания «Герой Социалистического Труда» и «Заслуженный деятель науки России». Награжден тремя орденами Ленина, орденами Октябрьской Революции, Трудового Красного Знамени.
Василий Степанович Пустовой скончался 11 октября 1972 года в городе Краснодар. Похоронен на Славянском кладбище краевой столицы.